Neues Nukleinsäure-Nachweiskit für das Coronavirus (SARS-Cov-2).
New Coronavirus(SARS-Cov-2) Nucleic Acid Detection Kit
(FluErzscent RT-PCR Probe Method) Product Manual
【Product name 】Neues Coronavirus (SARS-Cov-2) Nukleinsäure-Nachweiskit (Fluoreszierende RT-PCR-Sondenmethode)
【Packaging specifications 】25 Tests/Kit
【Intended usAlter】
Dieses Kit wird für den qualitativen Nachweis von Nukleinsäure aus dem neuen Coronavirus in Nasopharyngealabstrichen, oropharyngealen (Rachen-)Abstrichen, vorderen Nasenabstrichen, mittleren Nasenmuschelabstrichen, Nasenspülungen und Nasenaspiraten von Personen verwendet, bei denen von ihrem Gesundheitsdienstleister der Verdacht auf COVID-19 besteht. Der Nachweis der ORF1ab- und N-Gene des neuen Coronavirus kann zur Hilfsdiagnose und epidemiologischen Überwachung einer neuen Coronavirus-Infektion genutzt werden.
【Principles of the procedure 】
Dieses Kit ist für spezifische TaqMan-Sonden und spezifische Primer konzipiert, die für die ORF1ab- und N-Gensequenzen des neuartigen Coronavirus (SARS-Cov-2) entwickelt wurden. Die PCR-Reaktionslösung enthält 3 Sätze spezifischer Primer und Fluoreszenzsonden für den spezifischen Nachweis von Zielen, und ein zusätzlicher Satz spezifischer Primer und Fluoreszenzsonden wird als interne Standardkontrolle des Kits zum Nachweis endogener Housekeeping-Gene verwendet.
Das Testprinzip besteht darin, dass die spezifische Fluoreszenzsonde durch die Exonukleaseaktivität des Taq-Enzyms in der PCR-Reaktion verdaut und abgebaut wird, sodass die Reporter-Fluoreszenzgruppe und die gelöschte Fluoreszenzgruppe getrennt werden, sodass das Fluoreszenzüberwachungssystem eine Fluoreszenz empfangen kann Signal, und dann erreicht das Fluoreszenzsignal der Sonde durch den Anreicherungseffekt der PCR-Amplifikation einen festgelegten Schwellenwert – Ct-Wert (Zyklusschwelle). Wenn kein Ziel-Amplifikat vorhanden ist, befindet sich die Reportergruppe der Sonde nahe an der Löschgruppe. Zu diesem Zeitpunkt findet der Fluoreszenzresonanzenergietransfer statt und die Fluoreszenz der Reportergruppe wird durch die Löschgruppe gelöscht, so dass das Fluoreszenzsignal nicht vom Fluoreszenz-PCR-Instrument erfasst werden kann.
Um die Verwendung von Reagenzien während des Tests zu überwachen, ist das Kit mit Positiv- und Negativkontrollen ausgestattet: Die Positivkontrolle enthält das rekombinante Plasmid der Zielstelle und die Negativkontrolle ist destilliertes Wasser, das zur Überwachung der Umweltverschmutzung verwendet wird. Es wird empfohlen, beim Testen gleichzeitig eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle einzusetzen.
【Main components 】
| Cat. No. | BST-SARS-25 | BST-SARS-DR-25 | Components | |
| Name | Spezifizierung | Quantität | Quantität | |
| Positivkontrolle | 180 μL/Fläschchen | 1 | 1 | Künstlich hergestellte Plasmide, destilliertes Wasser |
| Negativkontrolle | 180 μL/Fläschchen | 1 | 1 | Destilliertes Wasser |
| SARS-Cov-2-Mix | 358,5 μL/Fläschchen | 1 | / | Spezifische Primerpaare, spezifische Detektionsfluoreszenzsonden, dNTPs, MgCl2, KCl, Tris-Hcl, destilliertes Wasser usw |
| Enzymmischung | 16,5 μL/Fläschchen | 1 | / | Taq-Enzyme, Reverse Transkriptase, UNG-Enzyme usw. |
| SARS-Cov-2-Mix (lyophilisiert) | 25 Tests/Fläschchen | / | 1 | Spezifische Primerpaare, spezifische Fluoreszenzdetektionssonden, dNTPs, Taq-Enzyme, Reverse Transkriptase, destilliertes Wasser usw. |
| 2x Puffer | 375 μL/Fläschchen | / | 1 | MgCl2, KCl, Tris-Hcl, destilliertes Wasser usw. |
Notiz::(1) Die Komponenten in verschiedenen Chargen-Kits können nicht gemischt oder ausgetauscht werden.
(2) Bereiten Sie Ihr eigenes Reagenz vor: Nukleinsäure-Extraktionskit.
【Storage condes ichons Und expiration date 】
For BST-SARS-25:Transportieren und lagern Sie es über einen längeren Zeitraum bei -20 ± 5 °C.
For BST-SARS-DR-25:Transport bei Raumtemperatur. Lange Zeit bei -20 ± 5 °C lagern.
Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Zyklen. Die Gültigkeitsdauer ist vorläufig auf 12 Monate festgelegt.
Das Herstellungs- und Verwendungsdatum finden Sie auf dem Etikett.
Nach dem ersten Öffnen kann das Reagenz bei -20 ± 5 °C nicht länger als 1 Monat oder bis zum Ende des Reagenzzeitraums gelagert werden, je nachdem, welches Datum zuerst eintritt, um wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen und die Anzahl der Reagenzien zu vermeiden, die einfrieren -Auftauzyklen sollten 6 Mal nicht überschreiten.
【Applicable instrument】ABI 7500, SLAN-96P, Roche-LightCycler-480.
【Sample requirements 】
1.Anwendbarer Probentyp: Extrahierte Nukleinsäurelösung.
2. Probenlagerung und -transport: 6 Monate lang bei -20 ± 5 °C lagern. Die Proben nicht öfter als 6 Mal einfrieren und auftauen.
【Testing method】
1.Nucleic acid extraction
Wählen Sie ein geeignetes Nukleinsäure-Extraktionskit zur Extraktion viraler Nukleinsäure aus und befolgen Sie die entsprechenden Kit-Anweisungen. Es wird empfohlen, ein von Yixin Bio-Tech (Guangzhou) Co., Ltd. hergestelltes Nukleinsäure-Extraktions- und -Reinigungskit oder ein gleichwertiges Nukleinsäure-Reinigungskit zu verwenden.
2. Reaction reagent preparation
2.1 For BST-SARS-25:
(1) Entfernen Sie die SARS-Cov-2-Mischung und die Enzymmischung, schmelzen Sie sie vollständig bei Raumtemperatur, mischen Sie sie gründlich mit dem Vortex-Gerät und zentrifugieren Sie sie dann kurz.
(2) 16,5 μl Enzymmischung wurden zu 358,5 μl SARS-Cov-2-Mischung hinzugefügt und gründlich gemischt, um die gemischte Reaktionslösung zu erhalten.
(3) Bereiten Sie ein sauberes 0,2-ml-PCR-Oktalröhrchen vor und markieren Sie es mit 15 µL der oben genannten gemischten Reaktionslösung pro Vertiefung.
(4) 15 μl gereinigte Nukleinsäurelösung, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle hinzufügen und den Deckel des Oktalröhrchens sorgfältig abdecken.
(5) Durch Umdrehen gut mischen und schnell zentrifugieren, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu konzentrieren.
1
2.2 For BST-SARS-DR-25:
( 1) Fügen Sie 375 μl 2x-Puffer zum SARS-Cov-2-Gemisch ((lyophilisiert) hinzu, um das Reaktionsgemisch vorzubereiten. Durch Pipettieren gründlich mischen und dann kurz zentrifugieren. （Sobald das Reaktionsgemisch vorbereitet ist, wird empfohlen, es bei -20 °C zu lagern Langzeitlagerung.）
(2) Bereiten Sie ein sauberes 0,2-ml-PCR-Oktalröhrchen vor und markieren Sie es mit 15 μl Reaktionsmischung pro Vertiefung.
(3) 15 μl gereinigte Nukleinsäurelösung, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle hinzufügen und den Deckel des Oktalröhrchens sorgfältig abdecken.
(4) Durch Umdrehen gut mischen und schnell zentrifugieren, um die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens zu konzentrieren.
3. PCR amplification （Informationen zu den Betriebseinstellungen finden Sie im Gerätehandbuch.）
3. 1 Stellen Sie das PCR-8-Röhrchen in die Probenkammer des fluoreszierenden PCR-Geräts und legen Sie die zu testende Probe, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle entsprechend der Reihenfolge der Beladung ein.
3.2 Fluoreszenz-Detektionskanal:
(1) Das ORF1ab-Gen wählt den Detektionskanal von FAM (Reporter: FAM, Quencher: Keiner).
(2) Das N-Gen wählt den Detektionskanal von VIC aus (Reporter: VIC, Quencher: Keiner).
(3) Das interne Standardgen wählt den Detektionskanal von CY5 aus (Reporter: CY5, Quencher: Keiner).
(4) Die passive Referenz wird auf ROX gesetzt.
3.3 PCR-Programmparametereinstellung:
| Schritt | Temperatur (℃) | Zeit | Anzahl der Zyklen | |
| 1 | Reverse Transkriptionsreaktion | 50 | 15 Min | 1 |
| 2 | Aktivierung des Taq-Enzyms | 95 | 2,5 Min | 1 |
| 3 | Aktivierung des Taq-Enzyms | 93 | 10 s | 43 |
| Annealing-Verlängerung und Fluoreszenzerfassung | 55 | 30 s | ||
Speichern Sie nach dem Einstellen die Datei und führen Sie das Reaktionsprogramm aus.
4.Results analysis
Nach Programmende werden die Ergebnisse automatisch gespeichert und die Amplifikationskurve analysiert. Die Verstärkungskurve ist auf den Standardschwellenwert des Geräts eingestellt.
【Explanation of test results 】
1. Bestimmen Sie die Gültigkeit des Experiments: Der FAM- und VIC-Kanal der Positivkontrolle sollte eine typische Amplifikationskurve aufweisen und der Ct-Wert liegt im Allgemeinen unter 34, kann jedoch aufgrund unterschiedlicher Schwellenwerteinstellungen verschiedener Instrumente schwanken. Der FAM- und VIC-Kanal der Negativkontrolle sollte nicht amplifiziertes Ct sein. Es wird vereinbart, dass die oben genannten Anforderungen gleichzeitig erfüllt sein müssen, andernfalls ist diese Prüfung ungültig.
2. Ergebnisurteil
| FAM/VIC-Kanal | Urteilsergebnis |
| CT<37 | Probentest ist positiv |
| 37≤Ct<40 | Die Amplifikationskurve ist S-förmig und verdächtige Proben müssen erneut untersucht werden; Wenn die Ergebnisse der erneuten Untersuchung konsistent sind, wird dies als positiv beurteilt, andernfalls als negativ |
| Ct≥40 oder keine Verstärkung | Der Probentest ist negativ (oder liegt unter der unteren Nachweisgrenze des Kits). |
Hinweis: (1) Wenn sowohl der FAM-Kanal als auch der VIC-Kanal gleichzeitig positiv sind, wird SARS-Cov-2 als positiv bestimmt.
(2) Wenn der FAM-Kanal oder VIC-Kanal positiv und der andere Kanal negativ ist, sollte der Test wiederholt werden. Wenn es gleichzeitig positiv ist, wird es als SARS-Cov-2-positiv beurteilt, andernfalls wird es als SARS-Cov-2-negativ beurteilt.
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